जीवाणू स्वत:च्या पेशीमध्ये विषाणूची वाढ थांबवण्यासाठी विविध रेणवीय साधने (Tools) वापरतात. निर्बंधन विकरे हे त्यांपैकी एक महत्त्वाचे साधन आहे. या विकरांना निर्बंधन विकरे, निर्बंधन एंडोन्यूक्लिएज किंवा रिस्ट्रिक्टेझ (Restriction enzymes/Endonuclease/ Restrictase) असेही म्हणतात. न्यूक्लिएज (Nuclease) प्रकारात मोडणारी ही विकरे जीवाणूंच्या प्रतिकार यंत्रणेचा भाग असतात. निर्बंधन विकरे जीवाणू पेशीमध्ये घुसलेल्या विषाणूंच्या (Bacteriophage) डीएनएचे तुकडे तुकडे करतात आणि विषाणूंची वाढ थांबवतात.
निर्बंधन विकरांच्या अस्तित्वाचा अप्रत्यक्ष पुरावा १९५०–६० या दशकाच्या सुरुवातीला मिळाला होता. साल्व्हाडोर लुरिया (Salvador Luria), जीन वीगल (Jean Weigle) आणि जूझेप्पे बर्तानी (Giuseppe Bertani) हे वैज्ञानिक λ-बॅक्टेरिओफाज याचा अभ्यास करत होते. या विषाणूची वाढ ई. कोलायच्या काही प्रभेदांमध्ये वेगाने तर अन्य काही प्रभेदांमध्ये संथपणे होत होती. हे पाहून त्यांनी असा निष्कर्ष काढला की, पेशींमधील एखादा घटक विषाणूच्या वाढीला मज्जाव करत असावा. वेर्नर आर्बर (Werner Arber) या स्विस वैज्ञानिकांनी १९६० मध्ये निर्बंधन विकरे कशी काम करतात याचे स्पष्टीकरण दिले. १९७० मध्ये हॅमिल्टन स्मिथ (Hamilton Smith) आणि १९७१ मध्ये डॅनिएल (दान्येल) नेथन्स (Daniel Nathans) या अमेरिकन वैज्ञानिकांनी हिमोफिलस इन्फ्लुएंझी (Haemophilus influenzae) या जीवाणूपासून HindII (HindII) हे निर्बंधन विकर वेगळे करण्यात यश मिळवले. त्यांच्या प्रयोगांमधून निर्बंधन विकरांचे कार्य सुस्पष्ट झाले आणि त्यांची डीएनए फेरबदल (DNA manipulations) घडवण्याची क्षमता प्रकाशात आली. या लक्ष्यवेधी शोधासाठी वेर्नर आर्बर, हॅमिल्टन स्मिथ आणि डॅनिएल (दान्येल) नेथन्स यांना १९७८ मध्ये नोबेल पुरस्काराने गौरवले गेले.
निर्बंधन विकरांची कार्यपद्धती : बहुतेक निर्बंधन विकरे एंडोन्यूक्लिएज (Endonuclease) या प्रकारची असतात. अर्थात ही विकरे डीएनए साखळीच्या मध्यात छेद घेऊन न्यूक्लिओटाइडे काढून टाकतात. जीवाणू पेशींमध्ये निर्बंधन विकरे मिथायलेज विकरांच्या साहाय्याने काम करतात. परकीय डीएनए पेशीमध्ये घुसताच ही प्रणाली सक्रिय होते. मिथायलेज विकरे, पेशींच्या डीएनए टोकांना जाऊन जुळतात आणि विघटनापासून त्याचे संरक्षण करतात. निर्बंधक विकरे परकीय डीएनएवरील ठराविक क्रम ओळखतात आणि तेथे जाऊन चिकटतात. या विशिष्ट स्थानांना ओळखस्थान (Recognition site) म्हणतात. निर्बंधन विकर ओळखस्थानापाशी एका विशिष्ट ठिकाणी डीएनए शृंखलेमधील (Sugar-phosphate backbone) शर्करा व फॉस्फेटमधील फॉस्फो-डाय-एस्टर बंध स्थानावर परिणाम करते. त्यामुळे हा बंध सुटा होतो. या स्थानाला निर्बंधन स्थान (Restriction site) असे म्हणतात. काही विकरांसाठी ही दोन्ही स्थाने एकच असतात, तर काही निर्बंधन विकरांसाठी ही दोन्ही स्थाने भिन्न असतात. अनेक ठिकाणी शर्करा-फॉस्फेट बंध नष्ट झाल्याने परकीय डीएनएचे तुकडे पडतात. अशा प्रकारे परकीय डीएनए निष्क्रीय होतो. या प्रक्रियेला निर्बंधक-विघटन (Restriction digestion) असे नाव आहे.
निर्बंधन विकराचे काम योग्य पद्धतीने होण्यासाठी निर्बंधन स्थानावरील आधारक जोड्यांचा विशिष्ट क्रम आवश्यक असतो. हा क्रम सर्वसाधारणपणे ४−८ आधारक जोड्यांचा असतो. बहुतांश वेळा हे क्रम समरूप/सममिती (Self-symmetric) असतात. अशा क्रमांना ‘पॅलिंड्रोम क्रमʼ (Palindrome sequences) म्हणतात. या क्रमवारीच्या आधारे निर्बंधन विकर डीएनएच्या प्रत्येक शृंखलेमध्ये एक छेद देते. काही विकरे समोरासमोर छेद देतात. यातून तयार होणारी डीएनएची टोके बोथट असतात. उदा., Smal विकराचे निर्बंधन.
अन्य काही विकरांचे छेदस्थान एकमेकांपासून काही आधारक जोड्या लांब असते. त्यातून निर्माण होणाऱ्या डीएनएच्या टोकाला अधांतरी एक सर्पिल शृंखला असतात. त्यांना चिकट टोके म्हणतात. उदा., EcoRI विकराचे निर्बंधन.
आजवर पाच प्रकारच्या निर्बंधन विकरांचा शोध लागलेला आहे. संरचना, कार्यद्रव्य (Substrate), निर्बंधन स्थान व साहाय्यक घटक या निकषांच्या आधारे विकरांचे वर्गीकरण केले जाते.
चौथ्या प्रकारची निर्बंधन विकरे फक्त मिथिलीकरण (Methylation) झालेल्या डीएनए रेणूवर काम करतात, तर पाचव्या प्रकारची विकरे मार्गदर्शी आरएनएच्या मदतीने डीएनएचे तुकडे करतात. योग्य आरएनए क्रम वापरून हव्या असलेल्या लांबीचे डीएनए तुकडे मिळवण्यासाठी ही विकरे उपयुक्त ठरतात. २०२० मध्ये नोबेल पुरस्काराने गौरवण्यात आलेले क्रिस्पर तंत्रज्ञान (CRISPR Technology) या कार्यपद्धतीवर आधारलेले आहे.
निर्बंधन विकराचे नाव ज्या जीवाणूपासून विकर मिळवले आहे, त्याच्या नावावर अवलंबून असते. निर्बंधन विकराला नाव देण्याची पद्धत पुढीलप्रमाणे आहे. उदा., EcoRI विकराचे नाव ई. कोलाय या जीवाणूच्या नावातील अक्षरे (Eco), प्रभेदाच्या RY13 या नावातील आद्याक्षर (R) आणि वेगळे केलेल्या विकराचा क्रमांक (I) असे तयार झाले आहे.
विविध जीवाणूंमध्ये आढळणारी ३५०० पेक्षा अधिक निर्बंधन विकरे वेगळी करण्यात यश मिळाले आहे. १८०० पेक्षा अधिक निर्बंधन विकरांचे व्यावसायिक स्तरावर उत्पादन केले जाते.
निसर्गात विविध भूमिका बजावणारी ही विकरे जैव अभियांत्रिकीमध्ये साधने म्हणून वापरली जातात. निर्बंधन विकरांचा सर्वांत महत्त्वाचा उपयोग डीएनए पुनर्संयोजन तंत्रज्ञानामध्ये होतो. डीएनए रेणूमध्ये नेमक्या ठिकाणी छेद देऊन डीएनए क्रम जोडण्यासाठी तसेच प्लाझ्मिड वाहकांमध्ये जनुके समाविष्ट करण्यासाठी निर्बंधन विकरे उपयुक्त ठरतात. विशिष्ट निर्बंधन विकराच्या मदतीने प्लाझ्मिड वाहकांमध्ये ठराविक ठिकाणी छेद दिला जातो. आवश्यक असलेली जनुके तेथे जोडून बंधक (Ligase) विकरांच्या मदतीने वाहक पुन्हा सांधले जाते. हे पुनर्संयोजित प्लाझ्मिड वाहक आश्रयी पेशीपर्यंत (Host cell) जनुक पोहोचवते.
निर्बंधन विकरांचा आणखी महत्त्वाचा उपयोग म्हणजे प्रतिचित्रण (DNA mapping) हा होय. या पद्धतीमध्ये विविध विकरे वापरून डीएनएचे निर्बंधन-विघटन करतात. सदर्न ब्लॉटिंग (Southern blotting) तंत्राच्या मदतीने तयार झालेल्या तुकड्यांचे मापन केले जाते आणि निर्बंधन स्थळांचा नकाशा बनवला जातो. निर्बंधन विकरांचे कार्य त्यांच्या छेदस्थानातील विशिष्ट क्रमवारीवर अवलंबून असते. डीएनए क्रमामध्ये छेदस्थाने ठरलेली असतात. या क्रमामध्ये एखादे न्यूक्लिओटाइड बदलले तरीही या जागा बदलतात. म्हणजेच तयार झालेल्या डीएनएच्या तुकड्यांचा आकृतिबंध बदलतो. तसेच वेगवेगळी क्रमवारी असलेल्या डीएनएच्या विघटनाचे आकृतिबंध भिन्न असतात. क्रमनिर्धारणाच्या (Sequencing) सुलभ पद्धती विकसित होण्याआधी या पद्धतीने जनुकीय नकाशे बनवले जात असत.
निर्बंधन विकरांच्या या विशेष गुणधर्माच्या आधारे निर्बंधन खंड बहुरूपता (Restriction fragment length polymorphism) ही पद्धत विकसित केली गेली. जीनोममध्ये एखाद्या जनुकांच्या किती प्रती आहेत, हे शोधून काढण्यासाठी देखील ही पद्धत उपयोगी पडते. विविध सजीवांच्या जीनोमचा तुलनात्मक अभ्यास करण्यासाठीही हे उत्तम साधन ठरत आहे. उत्परिवर्तनाचा अभ्यास करण्यासाठी व उत्क्रांतीमध्ये जनुके कशी बदलतात याचा आढावा घेण्याचे हे एक सोपे आणि प्रभावी साधन आहे.
विकारविज्ञानामध्येही (Disease biology) निर्बंधन विकरांचा वापर केला जातो. दात्रपेशी पांडुरोग (Thalassemia/Sickle cell anaemia), पुटीय तंतुमयता (Cystic fibrosis) यांसारखे काही विकार हे एकाच जनुकांमध्ये ठराविक ठिकाणी उत्परिवर्तन घडल्याने होतात. निर्बंधक विकरांच्या साहाय्याने एखाद्या व्यक्तीच्या जीनोममध्ये विकराचे उत्परिवर्तन अस्तित्वात आहे किंवा नाही हे शोधून काढता येते. विकराचे जनुक छेदणारे निर्बंधन विकर वापरून डीएनएचे विघटन करतात. उत्परिवर्तित जनुक असल्यास निर्बंधन विकर त्याचे तुकडे करते आणि एकापेक्षा अधिक तुकडे मिळतात. अन्यथा डीएनएचा तुकडा अखंड राहतो. डीएनए क्रमनिर्धारण करण्यापेक्षा ही पद्धत कमी खर्चिक ठरते.
न्यायवैद्यकामध्येही निर्बंधन विकरे वापरली जातात. वेगवेगळ्या डीएनए खंडांचे (DNA segment) निर्बंधन केले असता भिन्न आकृतिबंध तयार होतात. म्हणजेच प्रत्येक व्यक्तीच्या डीएनएचे निर्बंधन आकृतिबंध वेगळे असतात. या पद्धतीला ‘डीएनए अंगुलिमुद्रणʼ (DNA fingerprinting) असे म्हणतात. याचा वापर गुन्ह्यांच्या तपासामध्ये तसेच पितृत्व चाचणीमध्ये (Paternity testing) केला जातो.
निर्बंधन विकरांच्या शोधाने जैवतंत्रज्ञानाच्या क्षेत्रात अनेक महत्त्वाचे बदल घडले. सजीवांच्या जीनोमचे विश्लेषण करण्याच्या आधुनिक पद्धती यातून विकसित झाल्या. तसेच डीएनए पुनर्संयोजनाची प्रक्रिया सुकर करण्यामध्ये निर्बंधन विकरांचा मोठा वाटा आहे.
पहा : डीऑक्सिरायबोन्यूक्लिइक अम्ल (डीएनए), जनुक संपादन तंत्र-क्रिस्पर.
संदर्भ :
- Di Felice Francesca, Michelle Gioacchino, Camilloni Giorgio, Restriction enzymes and their use in molecular biology:An overview, J Biosci, 2019.
- https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
- Roberts Richard J, VinczeTamas, Posfai Janos, Macelis Dana,2007, REBASE- enzymes and genes for DNA restriction and modification, Nucleic Acids Research, 35,1,1 269.
- Roberts Richard J., How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology, PNAS, 102, 17, 5905, 2005.
- Szczelkun MD and Halford SE, Restriction Endonuclease, Brenner’s Encyclopedia of Genetics, 2nd ed., Vol 6, 184, 2013.
समीक्षक : प्रमोद जोगळेकर
